GraFIX, eine Methode für die Einzelpartikelanalyse im Kryoelektronenmikroskop (Kryo-EM)
Abb 1.: GraFIX Methode: Das Zentrifugationsröhrchen enthält einen Gradienten aus Glycerol oder Sucrose und Vernetzungs-reagenz (z.B. Glutaralded oder Formaldehyde). Aufgetrennt wird nach der Sedimentationsgeschwindigkeit (Rate Zonal Centrifugation). Die GraFix-Behandlung verbessert die Eigenschaften und die Stabilität der Molekülkomplexe im Gegensatz zur unbehandelten Probe, die Degradations- und Destabilisierungsartefakte aufweist.
Für die Strukturbestimmung von Einzelpartikeln im Kryo-EM werden aufgereinigte Proteine im nativen Zustand eingefroren (vitrifiziert). Allerdings ist der Kontrast aufgrund der niedrigen Dichte von Proteinen sehr gering ausprägt. Mit einer Negativfärbung kann zwar der Kontrast erhöht werden, jedoch ist die ungefärbte, native Strukturanalyse die Methode der Wahl. Während der Aufreinigung von Makromolekülen kommt es zudem häufig zu einer Heterogenität der Probe durch Abbauprozesse und zu einer Destabilisierung der Proteinkomplexe durch in-vitro Pufferlösungen. Diese und weitere Komplikationen können eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion stark beeinträchtigen.
Mit Hilfe der GraFix- Methode (Gradienten Fixation) kann die Qualität und Stabilität von Proteinen für die Einzelpartikelanalyse drastisch erhöht werden (Kastner et al., 2008; Stark et al. 2010). In der Regel werden Makromoleküle mittels Dichtegradienten-Ultrazentrifugation aufgereinigt und aufkonzentriert. Die GraFix-Methode setzt genau hier an. Während der rate-zonal Dichtegradienten-zentrifugation werden die Makromoleküle einem niedrig-dosierten chemischen Vernetzungsmittel (Fixativ) ausgesetzt. Dieses wird direkt bei der Herstellung des Gradienten zugeführt (Abb. 1).
Dichtegradienten können durch die tilted-rotation-Methode mit einem Gradient Master oder einer Gradient Station der Firma BioComp in wenigen Minuten hergestellt werden. Es entstehen lineare Gradienten mit aufsteigender Konzentration z.B. an Glycerol oder Sucrose und einem aufsteigenden Gehalt an Fixativ. Diesen Dichtegradienten durchlaufen die Moleküle während der Ultrazentrifugation wobei sie nach ihrer Sedimantationsgeschwindigkeit aufgetrennt werden. Am Ende der Ultrazentrifugation entstehen entsprechende Banden von aufgereinigten Molekülen, die eine sanfte Fixierung durchlaufen haben. Aus den Ultrazentrifugationsröhrchen kann die aufkonzentrierte Probe dann z.B. manuell mit einer Kanüle, entnommen werden. Für eine höhere Reinheit und Reproduzierbarkeit kann die Entnahme mit einem BioComp Fractionator oder einer Gradient Station erfolgen. Die Probe kann hierbei direkt per UV-Absorption oder Fluoreszenz-emission mit einer TRIAX Durchflussmesszelle analysiert werden.
Nach der Fraktionierung können die Einzelpartikel per Negativfärbung zusätzlich kontrastiert oder nach einem kurzen Pufferaustausch ohne Färbung direkt im Kryo-EM untersucht werden.
In verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass die GraFix-Methode die Abbildungsqualität der Einzelpartikeleigenschaften als auch der Moleküldispersion im Kryo- EM deutlich verbessert (Stark et al. 2010; Wang et al. 2022). GraFix ist im hohen Maße reproduzierbar und für den routine-mäßigen Einsatz geeignet.
Kastner B. et al. 2008, Nat Methods “GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy.”
Stark H. et al. 2010, Methods Enzymol “GraFix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM.”
Wang L. et al. 2022, Nat Commun “Structure of nucleosome-bound human PBAF complex”